Leite de vaca

Leite de vaca pode ser eficaz contra a Covid-19

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Estudo norte-americano indica que as propriedades antivirais de uma proteína encontrada no leite de vaca podem inibir a ação do Covid-19 e suas variantes.

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Um estudo da Universidade de Michigan, nos Estados Unidos, e da Glanbia PLC Research and Development, publicado no Journal of Dairy Science, indica que as propriedades antivirais de uma proteína encontrada no leite de vaca podem inibir a ação do coronavírus, que causa a Covid-19. Trata-se da lactoferrina, encontrada no leite da maioria dos mamíferos, mas que no caso do leite bovino, possui características bioativas específicas, capazes de combater micróbios e vírus, inclusive o SARS-CoV-2 e suas variantes e bloquear a capacidade do vírus de entrar nas células humanas.

ABSTRATO

A lactoferrina bovina (bLF), uma glicoproteína natural encontrada no leite, possui características bioativas contra muitos micróbios, vírus e outros patógenos. A lactoferrina bovina inibe fortemente a infecção por SARS-CoV-2 in vitro por meio de inibição de entrada direta e mecanismos imunomoduladores. Este estudo relata a eficácia anti-SARS-CoV-2 de bLF comercialmente disponíveis e ingredientes lácteos comuns na linha de células de pulmão humano H1437 usando um pipeline de análise e imagem de alto conteúdo personalizado. Também mostramos pela primeira vez que o bLF tem eficácia potente em diferentes cepas virais, incluindo as variantes sul-africana B.1.351, UK B.1.1.7, brasileira P.1 e indiana Delta. Curiosamente, mostramos que bLF é mais potente contra a variante B.1.1.7 [concentração inibitória semi-máxima (IC50) = 3,7 µg/mL], sugerindo que esta cepa depende de mecanismos de entrada que são fortemente inibidos por bLF. Também mostramos que um dos principais produtos de proteólise do bLF, a lactoferricina B 17-41, tem uma atividade anti-SARS-CoV-2 modesta que pode aumentar o significado clínico dessa proteína para o tratamento de SARS-CoV-2, pois a lactoferricina é liberada pela pepsina durante a digestão. Finalmente, mostramos que os comprimidos mastigáveis ​​de lactoferrina formulados em dextrose ou sorbitol têm potência equivalente a amostras não formuladas e fornecem uma opção para futuros ensaios clínicos em humanos. A ampla inibição da lactoferrina das variantes do SARS-CoV-2 em conjunto com o baixo custo e a facilidade de produção tornam este um candidato clínico empolgante para tratamento ou prevenção de SARS-CoV-2 no futuro.

INTRODUÇÃO

A lactoferrina (LF) é uma glicoproteína catiônica de ocorrência natural. É encontrado no leite da maioria dos mamíferos e faz parte do sistema imunológico inato. A lactoferrina exibe uma ampla variedade de características bioativas endogenamente como parte do sistema imunológico inato (Legrand e Mazurier, 2010) ou como suplemento alimentar (Moreno-Expósito et al., 2018). As bioatividades estabelecidas do LF exógeno são sua capacidade de inibir o crescimento microbiano, adesão e agregação via sequestro de ferro (Parrow et al., 2013). A lactoferrina também funciona através de mecanismos independentes de ferro (Rosa et al., 2017), oferecendo proteção contra vírus envelopados e não envelopados por meio de ligação direta às células hospedeiras ou partículas virais (Valenti e Antonini, 2005). A lactoferrina também atua através de outros mecanismos imunomoduladores para apoiar os mecanismos de defesa celular (Siqueiros-Cendón et al., 2014).

A lactoferrina bovina (bLF) apresenta atividade antiviral de amplo espectro tanto in vitro quanto in vivo (van der Strate et al., 2001; Jenssen e Hancock, 2009; Wakabayashi et al., 2014). Os resultados in vitro mostram que o bLF inibe o vírus sincicial respiratório (RSV), vírus influenza A (H3N2, H1N1, H3N2), bem como vírus influenza A aviário (H5N1), rotavírus, adenovírus, poliovírus, ecovírus, vírus herpes simplex (HSV- 1, HSV-2) e outros vírus (Wakabayashi et al., 2014). A lactoferrina bovina também mostrou atividade antiviral em ensaios clínicos em humanos. Por exemplo, bLF administrado por via oral demonstrou melhorar a gravidade de infecções virais, incluindo rotavírus (Egashira et al., 2007) e norovírus (Wakabayashi et al., 2014). No entanto, estudos adicionais são necessários para entender o potencial do bLF como um antiviral de amplo espectro.

Um benefício chave para a ampla eficácia antiviral do LF é seu potencial para a prevenção ou tratamento de doenças emergentes. Isso é especialmente importante quando há opções de tratamento limitadas ou quando as opções de tratamento são muito caras para uso generalizado. Um exemplo altamente relevante de uma doença recentemente emergente é o SARS-CoV-2, que causa o COVID-19 e resultou em uma pandemia global (Spinelli e Pellino, 2020). Em dezembro de 2019, o SARS-CoV-2 surgiu como um novo betacoronavírus e, desde então, causou mais de 600.000 mortes nos Estados Unidos e mais de 4 milhões de mortes em todo o mundo em julho de 2021 (Dong et al., 2020).

Dada a eficácia e segurança antiviral de amplo espectro (Nappi et al., 2009; Cutone et al., 2020), efeitos colaterais mínimos (Nappi et al., 2009) e disponibilidade comercial de bLF, vários artigos de revisão sugeriram o uso de bLF como tratamento profilático ou pós-exposição para infecção por SARS-CoV-2 (Chang et al., 2020; Wang et al., 2020).

O potencial do bLF oral como agente antiviral para a infecção por SARS-CoV-2 é apoiado por várias observações de pesquisas anteriores, incluindo trabalhos in vitro sobre o betacoronavírus SARS-CoV relacionado. Quando o SARS-CoV surgiu em 2002, os pesquisadores estudaram a capacidade do bLF de inibir o SARS-CoV in vitro (Lang et al., 2011). A entrada de SARS-CoV nas células depende da associação viral com o proteoglicano de sulfato de heparan aniônico (HSPG) nas superfícies celulares que atuam como um cofator de pré-requisito para a ligação subsequente da proteína spike ao receptor da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) e infecção celular. Lang et al., 2011). Usando células HEK293E/ACE2-Myc, os pesquisadores conseguiram mostrar que o LF inibiu o SARS-CoV in vitro de maneira dependente da dose (Lang et al., 2011). Outra pesquisa confirmou que a associação de bLF com HSPG de superfície celular inibe várias cepas adicionais de CoV, como HCoV-OC43, HCoV-NL63 e HCoV-229E (Hu et al., 2021) da associação de HSPG e subsequente ligação da proteína spike com ACE2 .

Recentemente, mostramos que o bLF também tem forte eficácia in vitro contra o SARS-CoV-2, que emprega muitos dos mesmos mecanismos de entrada e replicação do SARS-CoV. Nossa tela de alto rendimento baseada em imagem de 1.425 compostos identificou o bLF como o principal sucesso com uma concentração inibitória semi-máxima (IC50) de 308 nM (26,8 µg/mL) na célula hepática humana Huh7 (Mirabelli et al., 2021) . Esta eficácia antiviral foi observada em várias outras linhagens de células humanas, incluindo LNCaP (próstata), Caco2 (colorretal) e iAEC2 (alveolar). A eficácia da lactoferrina bovina parece ser independente da linhagem celular, o que é digno de nota, pois muitos outros sucessos antivirais provaram ser dependentes da linhagem celular e menos relevantes para o estudo clínico (Tzou et al., 2020; Tworowski et al., 2021). A eficácia do bLF mostrou-se multimodal, pois houve inibição direta da ligação e imunomodulação da célula hospedeira, o que limitou a infecção. A inibição viral não foi observada no tratamento com transferrina, uma proteína de ligação ao ferro relacionada, o que confirmou um mecanismo de ação independente do ferro (Mirabelli et al., 2021).

Apesar do amplo lançamento de vacinas nos Estados Unidos, ainda há uma necessidade urgente de terapias alternativas para o tratamento ou prevenção do SARS-CoV-2 em todo o mundo. Atualmente, o único medicamento aprovado pela Food and Drug Administration para o tratamento da infecção por SARS-CoV-2 é o remdesivir, que deve ser administrado por via intravenosa e não demonstrou alta eficácia clínica (Spinner et al., 2020). Infelizmente, de acordo com a Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), grande parte do mundo em desenvolvimento não atingirá a imunização em massa até 2024 (OCDE, 2021), deixando uma grande população de pessoas vulneráveis ​​à doença. Além disso, o surgimento de variantes do SARS-CoV-2 com maior virulência tem sido motivo de preocupação, pois podem ser menos suscetíveis à vacina. Em particular, as variantes sul-africanas B.1.351, UK B.1.1.7, Brazilian P.1 e Delta mostraram-se mais virulentas e potencialmente mais mortais do que as cepas virais anteriores (Challen et al., 2021; Davies et al. ., 2021). Uma terapêutica disponível por via oral que cubra cepas emergentes, como bLF, seria ideal para tratar SARS-CoV-2 em áreas sem vacinação generalizada ou se novas cepas escaparem da vacina.

O objetivo deste estudo foi expandir a observação da potente eficácia anti-SARS-CoV-2 do bLF in vitro com um exame mais completo do bLF, bem como rastrear produtos lácteos comercialmente disponíveis para atividades antivirais. Dada a eficácia do bLF em experimentos anteriores, levantamos a hipótese de que outros produtos de proteína láctea bioativa purificada também podem ter atividade antiviral contra SARS-CoV-2. Além disso, objetivamos avaliar a eficácia do bLF e seu produto proteolítico lactoferricina B contra várias das novas variantes preocupantes do SARS-CoV-2, incluindo B.1.1.7, B.1.351 e P.1. Por fim, procuramos investigar estratégias de formulação para um par comprimido mastigável bLF-placebo que retenha eficácia in vitro e possa ser usado para um ensaio clínico humano SARS-CoV-2 no futuro.

MATERIAIS E MÉTODOS

 Lacticínios

A lactoferrina bovina e outros produtos lácteos foram obtidos da Glanbia Nutritionals na forma de pós. A saturação de ferro para amostras LF foi fornecida pela Glanbia Nutritionals e variou entre 15 e 18 mg de ferro/100 g de pó. As soluções de estoque frescas foram feitas antes de cada experimento para evitar a degradação ao longo do tempo. A lactoferricina B 17-41 (lactoferricina B25) foi obtida de Bachem (produto nº 4087382). Todas as amostras de produtos lácteos, incluindo lactoferricina B, foram solubilizadas em meio de cultura de células completo [meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Thermo Fisher Scientific), 10% de soro bovino fetal, 1× penicilina-estreptomicina] a 1 mg/mL, esterilizado usando 20 Filtros de seringa de μm e diluídos à mão antes de adicionar às células.

Células e vírus

As células H1437 e Vero E6 foram mantidas a 37°C e 5% de CO2 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (10-437-028, Fisher Scientific) e 1× penicilina-estreptomicina (15140122, Gibco). As células foram testadas para contaminação por micoplasma antes do uso e os resultados foram negativos. As cepas de SARS-CoV-2 (WA1, B.1.1.7, B.1.351, P.1 e Delta) foram obtidas da BEI Resources e propagadas em células Vero E6. Os títulos virais foram determinados por ensaios de dose infecciosa de cultura de tecidos mediana (TCID50) em células Vero-E6 usando o método Reed e Muench, 1938 por pontuação microscópica. Os títulos virais para estoques variaram entre 107 e 108 TCID50/mL. Todos os experimentos usando SARS-CoV-2 foram conduzidos na Universidade de Michigan sob os protocolos de Nível de Biossegurança 3 em conformidade com os procedimentos de contenção em laboratórios para uso pelo Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade de Michigan e Meio Ambiente, Saúde e Segurança.

 Bioensaio Anti-SARS-CoV-2

As células H1437 foram semeadas em placas de 384 poços (6057300, Perkin Elmer) a uma densidade de 5.000 células/poço e deixadas fixar durante a noite a 37°C e 5% de CO2. O volume total por poço de meio de cultura celular foi de 50 µL. No dia seguinte, 10 µL de meio foram removidos de cada poço e substituídos por 10 µL de meio contendo LF e produtos lácteos dissolvidos em uma concentração apropriada. As células foram devolvidas à incubadora por 24 h para pré-tratamento do produto lácteo. Após o pré-tratamento, as células foram transferidas para uma instalação de Nível de Biossegurança 3 e infectadas com SARS-CoV-2 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. As células foram deixadas à temperatura ambiente por 30 min e depois transferidas para uma incubadora por 48 h após a infecção . Após o período de infecção, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 min em temperatura ambiente, permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 por 20 min, lavadas 2x com PBS frio e bloqueadas com tampão de anticorpo (1,5% BSA, 1% soro de cabra e 0,0025% de Tween 20). As placas de 384 poços foram então seladas, descontaminadas na superfície e transferidas para um espaço BSL2 para rotulagem durante a noite com anticorpo primário antinucleocapsídeo SARS-CoV-2 a +4°C (número de catálogo ABIN6952432, Antibodies Online). Após a coloração do anticorpo primário, as células foram lavadas 2x com PBS e coradas com um conjunto de corante fluorescente otimizado contendo 1:1.000 Hoechst 33342 pentahidratado (bis-benzimida) para marcação nuclear e 1:1.000 anticorpo secundário Alexa-647 (anti-camundongo de cabra, A21235, Thermo Fisher) para marcação viral por 30 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas 2x com PBS, depois deixadas em um volume final por poço de 50 µL de PBS em preparação para imagens fluorescentes.

Imagem de fluorescência

Placas coradas fluorescentes foram fotografadas usando os microscópios de alto conteúdo Yokogawa Cell Voyager 8000 (CV8000) e Thermo Fisher CX5 com ampliação de 20 × e 10 ×, respectivamente. A imagem Yokogawa CV8000 foi realizada com 2 linhas de laser de excitação (405/640 nm) com um disco giratório confocal e tempos de exposição de 100 ms. A potência do laser foi ajustada para produzir a relação sinal-ruído ideal para ambos os canais. Imagens de projeção de intensidade máxima foram geradas a partir de 5 planos confocais com um tamanho de passo de 3 µm. O foco automático a laser foi realizado em um total de n = 9 campos por poço, o que representa aproximadamente 80% da área total do poço. As imagens Thermo Fisher CX5 foram tiradas com excitação de diodo emissor de luz (386/23 nm, 650/13 nm). Os tempos de exposição foram variados para alcançar a relação sinal-fundo ideal e as imagens foram coletadas em um único plano Z, conforme determinado pelo autofoco baseado em imagem no canal nuclear. Assim como nas imagens CV8000, foram coletados 9 campos por poço.

 Processamento de imagem

As imagens foram processadas usando o software de segmentação de células de código aberto CellProfiler 4.0 (McQuin et al., 2018). Um pipeline foi projetado para identificar tanto os núcleos (canal Hoechst 33342) quanto os objetos virais (canal Alexa Fluor 647). As células infectadas foram identificadas usando o módulo de objetos relacionados, onde qualquer núcleo contido em um objeto viral foi definido como infectado. Contagens de células e contagens de células infectadas foram exportadas no nível de campo e unidas com metadados de tratamento para análise posterior.

 Análise de dose-resposta

Os dados de imagem em nível de campo foram agrupados no nível do poço usando Excel (Microsoft Corp.). Uma pontuação de infecção bruta foi determinada tomando uma proporção de células infectadas para contagens totais de células por poço e multiplicando por 100. Devido à diferença nas porcentagens de infecção bruta observadas com diferentes cepas virais, os dados foram normalizados para o controle infectado por vírus, de modo que o a porcentagem bruta mais alta de células infectadas seria equivalente a 100% de infecção. As curvas de dose-resposta para esses dados foram ajustadas no GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software) usando um modelo de inclinação variável de 4 parâmetros semi-log.

Análise Estatística e Teste de Hipóteses

Todas as análises estatísticas e testes de hipóteses foram realizados usando o GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software). Específicos, incluindo tamanhos de amostra e outros dados importantes, estão incluídos no texto das legendas das figuras.

 Comprimidos mastigáveis ​​de lactoferrina para estudos clínicos em humanos

Comprimidos mastigáveis ​​personalizados de frutas vermelhas LF foram fornecidos pela Glanbia Nutritionals. Estes comprimidos foram formulados com sorbitol ou dextrose contendo 25% de bLF. Além disso, comprimidos de placebo (sem LF) foram gerados usando dextrose ou sorbitol como excipientes.

RESULTADOS

 Eficácia anti-SARS-CoV-2 de produtos lácteos bovinos

Dada a alta eficácia do bLF purificado in vitro, estávamos interessados ​​em avaliar a eficácia anti-SARS-CoV-2 de outros produtos lácteos comercialmente disponíveis contendo bLF. Esses produtos incluíam isolados de proteína de soro de leite, concentrados, Bioferrin 2000 e vários outros produtos com níveis mais altos de bLF. Nossa hipótese é que esses produtos lácteos podem ter maior eficácia do que o bLF sozinho devido à presença de proteínas bioativas adicionais. Para avaliar a eficácia, projetamos um ensaio de inibição de SARS-CoV-2 baseado em imagem usando a linha celular de adenocarcinoma de pulmão humano H1437 (Figura 1). Essa linhagem de células humanas foi escolhida devido à sua expressão de ACE2 e TMPRSS2, os 2 principais fatores de entrada necessários para a infecção por SARS-CoV-2 (Hoffmann et al., 2020). Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 384 poços antes da incubação durante a noite. Em seguida, os produtos proteicos foram adicionados em diluições de 10 pontos, 2 vezes (n = 3) a partir de uma concentração máxima de 400 µg/mL e deixados incubar por mais 24 h. Em seguida, as células foram infectadas com a cepa SARS-CoV-2 WA1 em um MOI de 5 e incubadas por 48 h. As células foram então fixadas e coradas com Hoechst 33342 e anticorpo anti-nucleocapsid protein (NP) para identificar núcleos e NP viral. As placas foram fotografadas usando microscopia de fluorescência de alto conteúdo com ampliação de 20x (9 campos por poço) e processadas usando o software de segmentação de células de código aberto CellProfiler 4.0 para identificar células infectadas e não infectadas. A porcentagem de infecção bruta de nível de poço foi calculada tomando uma proporção de contagens de células infectadas para o total de células por poço. As curvas de dose-resposta foram geradas usando dados normalizados para a média do controle viral (23,5% de infecção bruta = 100% de infecção normalizada). Um diagrama de fluxo para este processo é mostrado na Figura 1A. Imagens representativas para controles infectados e não infectados são mostradas na Figura 1B.

Leite de vaca

Figura 1Ensaio de inibição de SARS-CoV-2 baseado em imagem. (A) Células pulmonares humanas H1437 (i) foram plaqueadas em placas de 384 poços e incubadas durante a noite (ii). Em seguida, os produtos lácteos foram adicionados em uma série de diluição de 10 pontos, 2 vezes (n = 3) a partir de uma concentração máxima de 400 µg/mL e deixados para pré-incubar durante a noite (iii). Em seguida, a cepa SARS-CoV-2 WA1 foi adicionada em uma multiplicidade de infecção de 5 e incubada por 48 h após a infecção (iv) antes da fixação, coloração e imagem de fluorescência para identificar células infectadas (v). Por fim, o software de análise de imagem CellProfiler 4.0 (McQuin et al., 2018) foi usado para quantificar a infecção e gerar curvas de dose-resposta para produtos lácteos contra SARS-CoV-2 (vi). A figura foi gerada usando BioRender.com. (B) Imagens representativas para controles virais e não infectados (azul = núcleos celulares, vermelho = proteína do nucleocapsídeo viral). As imagens foram tiradas usando um microscópio de alto conteúdo Yokogawa CV8000 com ampliação de 20x. DMSO = dimetilsulfóxido. As barras de erro representam SEM.

No total, 9 amostras de proteína bioativa do leite obtidas da Glanbia Nutritionals foram avaliadas quanto à atividade anti-SARS-CoV-2 responsiva à concentração neste modelo. Os resultados para este experimento são mostrados na Tabela 1 com valores de IC50 relatados quando aplicável. Curvas de dose-resposta, bem como imagens representativas para amostras eficazes, estão incluídas na Figura 2A e 2B, respectivamente. Cinco das amostras tiveram eficácia com valores de IC50 variando de 21,8 a 156,0 µg/mL, e nenhuma foi agudamente citotóxica até 400 µg/mL. É importante notar que cada um dos produtos proteicos eficazes continha uma porcentagem significativa de bLF e seu IC50 foi correlacionado com esse valor (Figura 3A, r = -0,88, P = 0,049). Além disso, se o IC50 da amostra for normalizado para seu %bLF (IC50 somente bLF, Tabela 1 e Figura 3B), não observamos diferenças significativas nos valores resultantes conforme determinado por ANOVA unidirecional (F4,10 = 0,68, P = 0,62). Nossos dados sugerem que os outros componentes lácteos desses produtos não possuem atividade anti-SARS-CoV-2 de até 400 µg/mL e que a eficácia é totalmente dependente do bLF. Isso fornece um forte suporte para a alta especificidade da atividade bLF anti-SARS-CoV-2, que não é observada para outras proteínas bioativas do leite.

Tabela 1Eficácia de produtos lácteos contra SARS-CoV-21

1 Resultados do bioensaio anti-SARS-CoV-2. A porcentagem de lactoferrina bovina (bLF) em cada amostra está incluída, bem como suas concentrações de inibição de 50% (IC50 ± SEM) e concentrações citotóxicas de 50% (CC50).

2 Calculado assumindo que a eficácia da amostra foi apenas de bLF, tomando o produto de %bLF e a amostra IC50. NA = não aplicável.

3 Foram avaliados dois lotes diferentes de Bioferrin 2000 (Glanbia Nutritionals).

Figura 2Atividade anti-SARS-CoV-2 de produtos lácteos. (A) Curvas de dose-resposta para produtos lácteos. Os dados mostrados são a média ± SEM de séries de diluição de 10 pontos, 2 vezes (n = 3 réplicas por condição). O ajuste de curva foi realizado usando GraphPad Prism 9.0 usando um modelo de inclinação variável semi-log de 4 parâmetros. (B) Imagens representativas para amostras eficazes (por exemplo, 11-20-014-04) e o controle viral. Os núcleos celulares são mostrados em ciano; a proteína do nucleocapsídeo viral é mostrada em magenta. As imagens mostradas foram tiradas em um microscópio de alto conteúdo Yokogawa CV8000 com ampliação de 20 × e coloridas usando ImageJ (National Institutes of Health).

Figura 3 A eficácia da amostra depende da lactoferrina bovina (bLF). (A) Correlação de Pearson para concentração inibitória semi-máxima da amostra (IC50) versus porcentagem bLF (r = -0,88, P = 0,049). (B) IC50 somente bLF para amostras eficazes calculadas tomando o produto da fração bLF e a amostra IC50. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre as médias dos grupos, conforme determinado pela ANOVA one-way (F4,10 = 0,68, P = 0,62). As barras de erro representam SEM.

bLF Inibe P.1, B.1.1.7, B.1.351 e Variantes Delta

Para melhorar a relevância clínica e a traduzibilidade, testamos o bLF contra algumas das variantes mais comuns de preocupação do SARS-CoV-2. Estes incluíram a variante WA1 (estirpe US 2020), a variante B.1.1.7 (estirpe do Reino Unido), a variante B.1.351 (estirpe da África do Sul), a variante P.1 (estirpe Japão/Brasil) e a variante Delta (estirpe indiana tensão). Notavelmente, cada uma dessas variantes inclui modificações na proteína spike SARS-Cov-2 que põe em risco a eficácia de todas as vacinas recém-produzidas (Aleem et al., 2021). Além disso, cada uma dessas cepas apresenta neutralização reduzida por soros de vacinação (Supasa et al., 2021; Virtanen et al., 2021).

Usando o bioensaio anti-SARS-CoV-2 descrito anteriormente, avaliamos a eficácia do bLF contra essas cepas virais comuns (MOI = 5) em 10 pontos, diluição de 2 vezes a partir de uma concentração máxima de 200 µg/mL (n = 4). Descobrimos que bLF foi eficaz contra todas as variantes testadas, com valores de IC50 variando de 3,7 a 44,4 µg/mL (Figura 4A). Também descobrimos que o bLF foi capaz de prevenir a morte celular causada pelo vírus (Figura 4B), como resultado da diminuição da infecção celular. Curiosamente, a infecção com as diferentes cepas virais em um MOI equivalente resultou em diferentes porcentagens de infecção bruta para células H1437 e foi particularmente alta para a variante B.1.351 (Figura 4C). É importante notar que a infecção com várias das cepas, incluindo B.1.1.7, P.1 e Delta, não resultou em efeito citopático e, portanto, bLF não influenciou positivamente a viabilidade dessas cepas. A infectividade diferencial dessas cepas também é aparente na Figura 4D, que mostra imagens representativas para controles virais e células infectadas tratadas com 200 µg/mL de bLF. Essas imagens também mostram uma redução significativa no número de células positivas para a proteína do nucleocapsídeo viral após o tratamento com bLF. A potência de bLF foi maior contra a variante B.1.1.7 (IC50 = 3,7 µg/mL) e menor contra a variante P.1 (IC50 = 31,9 µg/mL), indicando que as mutações que afetam a proteína do pico viral se sobrepõem à mecanismo de inibição de bLF. Embora a potência não tenha sido a mais alta contra a cepa B.1.351 (IC50 = 31,0 µg/mL), a redução drástica na infecção demonstra que o bLF funciona contra cepas com maior infectividade e possui atividade de amplo espectro contra variantes de SARS-CoV-2.

Figura 4Eficácia da lactoferrina bovina (bLF) contra variantes preocupantes do SARS-CoV-2. (A) Valores de concentração inibitória semi-máxima (IC50) para bLF em células H1437 contra várias cepas de SARS-CoV-2. Todas as cepas virais foram avaliadas em uma multiplicidade de infecção de 5. Os valores de IC50 foram determinados usando GraphPad Prism 9, e os dados representam a média ± SEM de n = 4 réplicas. A significância estatística foi determinada usando os testes t de Student com correção de Welch no GraphPad Prism 9 (*P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). (B) Contagem de células/poço para controles virais versus tratamento com 50 µg/mL de bLF. Os dados mostram uma recuperação significativa (****P < 0,0001) da viabilidade celular após o tratamento com bLF para as cepas virais WA1 e B.1.351. (C) Porcentagem de células positivas para a proteína do nucleocapsídeo viral (NP) em uma multiplicidade de infecção = 5 para as diferentes variantes. A infecção por B.1.351 resultou no maior número de células infectadas após 72 h. As porcentagens brutas de infecção para todas as variantes foram significativamente diferentes umas das outras em P < 0,0001, exceto para B.1.1.7. e P.1, que não diferiram. (D) Imagens representativas para controles virais (dimetil sulfóxido, DMSO) e células infectadas tratadas com 200 µg/mL bLF. As imagens (ampliação de 10 ×) são uma sobreposição de núcleos celulares (azul) e proteína SARS-CoV-2 NP (vermelho). As imagens foram produzidas usando o software ImageJ (National Institutes of Health).

A lactoferricina B tem eficácia anti-SARS-CoV-2 modesta

O bLF administrado por via oral tem uma meia-vida relativamente curta in vivo (~10 min) como resultado da rápida digestão péptica pelo trato gastrointestinal (Elzoghby et al., 2020). O principal fragmento dessa digestão péptica é um peptídeo de 1,5 kDa chamado lactoferricina B (lactoferricina B 17-41), que demonstrou ter potente atividade antimicrobiana como resultado de sua natureza altamente catiônica. Com isso em mente, avaliamos a lactoferricina B sintética no bioensaio antiviral baseado em imagem para determinar se ela também tinha eficácia contra o SARS-CoV-2. A atividade antiviral foi avaliada contra as variantes WA1, B.1.1.7, B.1.351 e P.1 em 3 concentrações diferentes (200, 100 e 50 µg/mL) com n = 4 réplicas por condição. Descobrimos que a lactoferricina tem atividade antiviral estatisticamente significativa contra cada uma das cepas virais (Figura 5), ​​com valores de IC50 próximos ou superiores à concentração máxima de 200 µg/mL. A potência da lactoferricina B é muito menor do que a LF; no entanto, a atividade é significativa e pode contribuir para a eficácia geral do LF in vivo.

Figura 5A lactoferricina bovina 17–41 tem atividade anti-SARS-CoV-2 modesta in vitro. Gráfico de barras comparando 3 concentrações (50, 100 e 200 µg/mL) de lactoferrina bovina 17-41 contra 4 das variantes mais comuns de preocupação do SARS-CoV-2 (SCV2): WA1, B.1.351 (Sul-Africano), B.1.1.7 (Reino Unido) e P.1 (Brasileiro). Os dados representam a média ± SEM para n = 4 réplicas por condição. As porcentagens brutas de infecção para células tratadas com lactoferricina são mostradas em comparação com seu controle de veículo (Veh) (meio de cultura de células sem lactoferricina) para cada variante. A lactoferrina bovina 17-41 foi eficaz em diminuir a porcentagem de positividade viral dentro de cada uma das cepas de maneira dose-dependente. A significância foi determinada usando o teste t de Student com correção de Welch no GraphPad Prism 9 (**P < 0,01, ***P < 0,001).

Formulação de comprimido mastigável bLF para ensaio clínico

Em preparação para um ensaio clínico bLF em humanos, projetamos pares de comprimidos-placebo bLF com sabor de frutas mistas personalizados formulados com dextrose ou sorbitol. Para validar que a eficácia in vitro foi mantida para esses comprimidos formulados, nós os testamos no ensaio anti-SARS-CoV-2 baseado em imagem descrito anteriormente. As amostras placebo e ativas foram testadas em diluição de 10 pontos, 2 vezes a partir de uma concentração máxima de 400 µg/mL (n = 3). Os resultados desta experiência são apresentados na Figura 6. Verificamos que os excipientes (dextrose e sorbitol) não influenciaram a potência da amostra. As curvas de dose-resposta para essas amostras são mostradas na Figura 6A. Quando os valores de IC50 foram corrigidos para refletir a concentração de bLF na amostra, não houve diferença significativa entre as amostras formuladas e o padrão bLF (Figura 6B). Um resumo dos resultados é mostrado na Figura 6C. Em conjunto, esses dados validam que não há queda de eficácia dependente da formulação e que esses pares de amostra placebo seriam uma opção viável para um ensaio clínico anti-SARS-CoV-2.

Figura 6 Eficácia de formulações de comprimidos de lactoferrina bovina (bLF) para ensaios clínicos em humanos. (A) Curvas de dose-resposta para as diferentes formulações de lactoferrina examinadas. As amostras formuladas contendo bLF exibiram uma redução significativa da infecção por SARS-CoV-2 com concentração inibitória meia-máxima (IC50) para bLF formulado em sorbitol ou dextrose a 77,05 e 72,98 µg/mL, respectivamente. Os controles de sorbitol e dextrose não afetaram a porcentagem de infecção por SARS-CoV-2 como agentes únicos sem bLF. As curvas foram ajustadas no GraphPad Prism 9 usando um modelo de inclinação variável semi-log de 4 parâmetros. (B) comparação IC50 entre bLF purificado e bLF formulado com dextrose ou sorbitol. Os valores de IC50 relatados são corrigidos para refletir a porcentagem de bLF na amostra. Os dados são apresentados como a média ± SEM de n = 4 réplicas. Não houve significância estatística entre as amostras formuladas e não formuladas. A significância foi determinada usando testes t de Student com correção de Welch no GraphPad Prism 9. (C) Tabela de resumo comparando amostras formuladas e controles. CC50 = 50% de concentração citotóxica. NA = não aplicável.

DISCUSSÃO

Projetamos um ensaio in vitro baseado em imagem para infecção por SARS-CoV-2 usando a linhagem de células humanas H1437 para investigar as propriedades antivirais de bLF e outros produtos lácteos. Este ensaio personalizado usou as técnicas de imagem e análise de fluorescência de alto conteúdo, que produz milhares de observações de células por experimento e resulta em dados altamente robustos. Esta técnica de ensaio é superior às leituras bioquímicas tradicionais porque os dados são coletados em um nível de célula individual e as informações sobre a morfologia celular podem ser coletadas. Para este experimento, levantamos a hipótese de que esses produtos lácteos podem ter uma atividade independente ou maior potência antiviral do que o bLF purificado sozinho devido à presença de proteínas ou peptídeos bioativos adicionais. No total, testamos 9 amostras de laticínios diferentes, incluindo isolados de proteína de soro de leite, concentrados e produtos LF enriquecidos. Isolados de proteína de soro de leite e outros produtos lácteos purificados demonstraram atividade contra vírus no passado (Pan et al., 2006); no entanto, não observamos eficácia dessas amostras contra SARS-CoV-2. Descobrimos que quando houve eficácia para uma amostra, ela foi correlacionada com a fração de bLF, sugerindo que a atividade antiviral era de bLF sozinho. A maior eficácia foi observada para amostras de Bioferrin 2000 (média ± SEM; IC50 = 21,8 ± 1,2 µg/mL, cepa WA1) que contêm >90% bLF. É importante notar que não houve diferenças estatisticamente significativas entre a IC50 de amostras eficazes quando corrigidas para sua porcentagem de bLF, o que demonstra que bLF retém a potência in vitro quando em combinação com outras proteínas e peptídeos lácteos. A potência de bLF em H1437 (20,0 ± 1,2 µg/mL, cepa WA1) é consistente com nossos resultados relatados anteriormente em Huh7 (26,8 µg/mL, cepa WA1; Mirabelli et al., 2021), o que apóia ainda mais que a eficácia é independente da linha celular.

Dado que a eficácia desses produtos lácteos parecia ser exclusivamente de bLF, o restante de nosso projeto foi focado em expandir dados anteriores e fornecer suporte para o uso de bLF como uma terapêutica anti-SARS-CoV-2. Para estabelecer a atividade de amplo espectro, testamos bLF e seu produto de clivagem péptica, lactoferricina B, contra várias variantes de SARS-CoV-2, incluindo o WA1 (tipo selvagem), B.1.1.7 (Reino Unido), B.1.351 (Sul-Africano ), P.1 (brasileira) e Delta (índia). Descobrimos que bLF tem eficácia contra todas as cepas que foram testadas (Figura 4) e esperamos que também tenha atividade contra cepas emergentes adicionais no futuro. Das variantes testadas, bLF teve a maior potência contra a cepa B.1.1.7. Várias mutações foram observadas em B.1.1.7 com a mutação N501Y sendo uma mutação chave na proteína de ligação de pico que aumenta a afinidade para o domínio de ligação ao receptor (Ramanathan et al., 2021). A variação na eficácia de bLF contra variantes pode ser devido às suas afinidades diferenciais para HSPG de superfície celular, que auxiliam na entrada viral. Uma variante com uma afinidade mais alta para HSPG pode ser capaz de deslocar moléculas de bLF em concentrações mais baixas e, assim, resultar em um valor de IC50 menos potente. Esforços futuros de pesquisa sobre variantes de SARS-CoV-2 e bLF devem incluir o estudo dos pontos fortes da associação de cada variante com HSPG de superfície celular. A força da associação viral deve então ser comparada com a força da associação de bLF com HSPG. Isso pode ajudar a explicar por que o bLF tem graus de eficácia na inibição viral e aumento da potência contra B.1.1.7, embora a literatura mostre que B.1.1.7 tem uma afinidade de ligação mais alta com o receptor ACE2 (Shahhosseini et al., 2021). Além disso, pode haver uma interação de ligação direta entre bLF e a proteína spike, que é variável entre as variantes do SARS-CoV-2 e também pode explicar as potências variáveis. Pesquisas anteriores demonstraram que o bLF se liga e inibe diretamente vários outros vírus, incluindo adenovírus, vírus do herpes felino (FHV-1), vírus da hepatite C (HCV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV); no entanto, pesquisas adicionais são necessárias para confirmar a ligação direta ao SARS-CoV-2 (Redwan et al., 2014).

Neste projeto, selecionamos vários ingredientes lácteos para atividade anti-SARS-CoV-2 (Tabela 1). Proteínas de soro de leite e proteína de soro de leite hidrolisada demonstraram ter uma ampla gama de características bioativas, incluindo peptídeos bioativos que são criptografados na estrutura primária e liberados durante a hidrólise da proteína (Minj e Anand, 2020). Nossa triagem indicou que a inibição do SARS-CoV-2 estava fortemente correlacionada com o nível de bLF encontrado na amostra e era específico para bLF.

Um dos peptídeos criptografados encontrados em bLF é a lactoferricina f17-41 de LF e é produzida durante a digestão. Demonstrou-se que possui amplas características antimicrobianas e antivirais como um inibidor de bactérias, leveduras, fungos e vírus e pode funcionar como um peptídeo imunomodulador (Gifford et al., 2005). Nossa pesquisa indicou que a lactoferricina inibiu o SARS-CoV-2, embora exigisse concentrações significativamente maiores para inibição (Figura 5). A inibição, embora significativa, não pareceu linearmente dependente da concentração para todas as cepas. A natureza não linear da inibição pode ser devida a um mecanismo de ação não específico envolvendo ruptura da membrana viral devido à natureza altamente catiônica do peptídeo. A alta concentração necessária para alcançar uma eficácia significativa também suporta um mecanismo de ação não específico. Mais pesquisas são necessárias para confirmar um mecanismo de ação para a lactoferricina.

A modulação imune de bLF é de interesse porque fornece um método indireto para inibir a replicação viral e potencialmente melhorar a progressão da doença. Um artigo de revisão recente (Zimecki et al., 2021) resumiu pesquisas in vivo e in vitro que mostram um forte apoio ao LF para modular o sistema imunológico e sugeriu que pode ser um bom candidato para reduzir a gravidade da infecção por SARS-CoV-2 . O estudo de análise transcriptômica mostrou que as células epiteliais intestinais Caco-2 não infectadas na presença de bLF regulavam positivamente a expressão chave de citocinas antivirais (IFNA e IFNA1), receptores (TLR3 e TLR7) que são usados ​​para detectar vírus, e também uma regulação positiva da resposta da imunidade inata sinalização (IRF3, IRF7 e MAVS; Salaris et al., 2021). Isso fornece 2 áreas interessantes de pesquisa futura para bLF para entender melhor a inibição in vitro da ligação e fixação viral e o efeito indireto da modulação imune na infecção e replicação viral.

Uma área de pesquisa que está faltando são os dados clínicos humanos para apoiar a pesquisa in vitro. A entrega de lactoferrina bovina em forma de comprimido ou cápsula pode ser facilmente produzida, mas não se sabia se os excipientes comuns interfeririam na capacidade do bLF de inibir a inibição viral in vitro. A Figura 6 mostra que nem a dextrose nem o sorbitol inibem ou previnem a atividade antiviral de LF. Quando padronizado para o conteúdo de bLF, os resultados não foram significativamente diferentes do bLF purificado. Esses tipos de comprimidos podem ser usados ​​em um estudo clínico em humanos.

Por fim, uma das principais vantagens do bLF como potencial terapêutico para SARS-CoV-2 é sua robusta cadeia de suprimentos e ampla disponibilidade. A FL bovina purificada está disponível há várias décadas com uma produção estimada de 350 a 400 Mt em 2020 (Whey Book, 2020). Grande parte do LF comercialmente disponível é adicionado à fórmula infantil ou vendido como suplemento dietético. A lactoferrina também é designada pela Food and Drug Administration como geralmente reconhecida como segura (GRAS). Em contraste, uma limitação potencial ao uso de bLF para infecção por SARS-CoV-2 é que, devido à meia-vida curta de bLF, as concentrações in vitro de IC90 provavelmente não serão alcançadas no soro humano por longos períodos de tempo. No entanto, a atividade imunomoduladora sistêmica induzida por LF e produtos de clivagem proteolítica, como a lactoferricina B, não é modelada in vitro, e atividade adicional pode estar presente em todo o organismo. É provável que uma estratégia de formulação diferente, como um comprimido com revestimento entérico (evita a digestão péptica) ou um pó inalável (direcionamento direto para os pulmões) seja ideal para atingir concentrações adequadas de bLF para inibir o vírus. Outra opção para aumentar o potencial do bLF como uma terapêutica anti-SARS-CoV-2 seria usá-lo como terapia combinada com outros produtos naturais ou antivirais. Isso foi demonstrado in vitro em um estudo de sinergia com remdesivir, onde os 2 agentes individuais tiveram eficácia aditiva contra SARS-CoV-2 (Mirabelli et al., 2021).

No geral, a disponibilidade e o forte perfil de segurança do bLF o tornam um forte candidato para aplicações profiláticas e terapêuticas anti-SARS-CoV-2. Trabalhos futuros serão necessários para entender completamente o potencial antiviral para bLF em um ambiente clínico.

CONCLUSÕES

A lactoferrina bovina exibe um amplo espectro de atividade antiviral in vitro contra variantes do SARS-CoV-2, incluindo variantes sul-africana B.1.351, UK B.1.1.7, brasileira P.1 e indiana Delta. Várias fontes de proteínas lácteas e peptídeos bioativos foram rastreados quanto à atividade antiviral, mas a atividade antiviral foi específica para bLF e correlacionada com o teor de bLF em ingredientes lácteos. A lactoferricina B, um produto de degradação de bLF, também tem uma eficácia anti-SARS-CoV-2 fraca, o que poderia aumentar seu significado clínico. Dextrose e sorbitol, excipientes comuns usados ​​na fabricação de comprimidos, não interferiram na capacidade do bLF de inibir o SARS-CoV-2. A disponibilidade, segurança e eficácia in vitro do bLF o tornam um candidato promissor para pesquisas futuras no combate ao SARS-CoV-2.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos o financiamento do Instituto de Pesquisa Clínica e de Saúde da Universidade de Michigan (MICHR; Centro Nacional para Avanço de Ciência Translacional Grant UL1TR002240) e seu Centro de Reaproveitamento de Medicamentos. JZS é apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Renais (R01DK120623). O JWW é apoiado pela bolsa de treinamento T32 do Programa de Treinamento em Ciências Farmacológicas da Universidade de Michigan (PSTP). Agradecemos a Carla Pretto-Kernahan e Carmen Mirabelli (ambas da Faculdade de Medicina da Universidade de Michigan) pelas discussões ponderadas e por ajudar a preparar os estoques virais para nossos experimentos. Loren Ward é empregado da Glanbia Nutritionals e participa de um plano de incentivo de longo prazo; A Glanbia Nutritionals produziu a Bioferrina e outros ingredientes lácteos usados ​​no estudo. Os demais autores não declararam conflitos de interesse.

Fonte: Journal Ofdairy Science. Imagem principal: Depositphotos/ Valentyn_Volkov(Валентин Волков).


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